PCR və ya polimeraza zəncirvari reaksiya tibbdə və digər elmi sahələrdə geniş istifadə olunan mürəkkəb laboratoriya texnikasıdır. PCR diaqnostikası bir vaxtlar elmdə əsl sıçrayış oldu.
Təsvir
Kəmiyyətli PCR real vaxtda PCR növüdür.
Bu, mürəkkəb molekulyar qarışıqda xüsusi DNT nukleotid ardıcıllığının məzmununu keyfiyyətcə qiymətləndirməyə imkan verən reaksiyanın kinetikasının daim qeydə alındığı PCR variantı kimi başa düşülür.
Kəmiyyət PCR üsulu aşağıda daha ətraflı müzakirə olunacaq.
Təhlilin mahiyyəti
İnfeksiyaların diaqnostikası üçün kulturoloji və seroloji üsullardan xüsusilə tez-tez istifadə olunur. Birincisi, qan serumunda bir yoluxucu patogenə qarşı antikorlar təyin olunur. İkincisi, xəstə insandan götürülmüş bioloji material patogen koloniyaların böyüməsi üçün əlverişli olan xüsusi bir mühitin əkilməsi üçün istifadə olunur. Hər ikisində diaqnostikahal günlər və ya həftələr davam edə bilər.
PZR müayinəsi xəstə insandan alınan müxtəlif bioloji materiallarla aparıla bilər. Qan və digər patoloji, fizioloji və bioloji mühitlər və mayelər nümunə kimi çıxış edir. Siz nəcis və ya sidiyi PCR edə bilərsiniz.
Atipik və viral infeksiyalar ən çox kəmiyyət PCR ilə diaqnoz edilir, çünki onların törətdiyi patoloji prosesin spesifik təbiətinə görə diaqnoz qoymaq asan olmaya bilər. Belə infeksiyaları müəyyən etmək üçün vaxt lazımdır, bu müddət ərzində bədəndə seroloji üsullarla təyin olunan antikorlar istehsal olunmağa başlayır. Lakin bəzi hallarda bu qəbuledilməzdir.
İşləmə üsulu
PCR üsulu - xəstədən təcrid olunmuş nümunələrdə infeksiyanın laboratoriya aşkarlanması (in vitro).
Polimeraza zəncirvari reaksiya aparmaq üçün xüsusi reagentlər dəsti tələb olunur.
Sınaq materialı reagentlərlə sınaq borularına daxil edilir. Test boruları xüsusi aparata - istədiyiniz RNT və ya DNT fraqmentlərini gücləndirmək (sayı artırmaq) üçün nəzərdə tutulmuş PZR gücləndiricisinə yerləşdirilir, PCR gücləndiricisi siklik rejimdə işləyir. Hər hansı bir dövrdə, nümunələrdə patogenin RNT və ya DNT ardıcıllığı varsa, məhlulda bu nuklein turşularının hissəciklərinin getdikcə daha çox nüsxəsi toplanır. Siz patogenin varlığını və nümunələrdə onun miqdarını müəyyən edə bilərsiniz.
PCR növləri
PZR ilə keyfiyyət analizi aşağıdakı nəticəni əldə etməyə imkan verir:
- Nümunələrdə maraq doğuran patogen aşkar edilmədikdə mənfi;
- müəyyən patogen üçün xarakterik olan nümunələrdə ardıcıllıq aşkar edilərsə müsbətdir.
Müsbət PCR nəticəsi ilə diaqnoz qoyulmuş infeksiyanın olması haqqında 95% dəqiqliklə danışa bilərik. Eyni zamanda, diaqnostik məqsədlər üçün istifadə edilən PCR dəstlərinin dəqiqliyi 100%-ə çatır.
Adətən yanlış nəticələrin 5%-i insan faktoru ilə müəyyən edilir. Məsələn, reagentlərin təhlili və saxlanması texnikasının pozulması tədqiqatın dəqiqliyini əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər.
Kəmiyyət PCR virus yükü anlayışını müəyyən edir. Xəstədən götürülən nümunələrdə neçə dəst patogen DNT olduğunu müəyyən etmək mümkündür.
İnfeksiyanın şiddəti onların sayının artması ilə düz mütənasibdir. Viral yükü az altmaq üçün terapiyanın uğurunu da müəyyən edə bilərsiniz.
PZR biomaterialı üçün təqdimat
Kəmiyyət PCR klinikada əsasən səhər saatlarında aparılır. Həkimə səfər zamanı xəstəyə nə qəbul edilməli olduğu izah ediləcək: kazıma, ləkə, sidik və ya qan. PCR materialın çirklənmə səviyyəsindən asılı olmayaraq patogenləri aşkar edə bilər.
Müsbət analiz üçün nəzəri olaraq nümunələrdə yalnız bir patogenin olması tələb olunur. Praktikada daha da əlverişli şərait yaratmağa çalışırlar. Bunun üçün bəzi tövsiyələr var:
- cinsiyyət orqanlarından sıyrıntı və ya tampon götürsələrorqanlar, tədqiqatdan üç gün əvvəl intim əlaqədən çəkinməlisiniz;
- analizdən əvvəl antibakterial preparatlarla yuyula və ya özünüzü yuya bilməzsiniz;
- uretradan yaxma almadan üç saat əvvəl səbirli olmalı və bağırsaqlarınızı boş altmamalısınız.
Qan verərkən bu qaydalara əməl etməyin.
Kəmiyyət PCR analizinin nəticələri necə şərh olunur?
Alınan nəticələrin kəmiyyətcə qiymətləndirilməsi
Bir sıra klinik vəziyyətlərdə müalicənin effektivliyi və/yaxud patoloji prosesin dinamikası problemi yaranır. Xroniki infeksiyaları (insan immun çatışmazlığı virusu, hepatit B və C) olan insanları müayinə edərkən belə suallar xüsusilə aktualdır. Diaqnoz qoyularkən, onlar amplikonların (PZR məhsulları) yığılmasının təhlil edilən nümunədə arzu olunan genin nüsxələrinin olması ilə mütənasib olmasına əsaslanır.
Təbii ki, kəmiyyət PCR nəticələrini nəzərə alaraq xüsusi PCR siqnallarının intensivliyinin öyrənilməsi ilə gel elektroforezi ilə aparılır. Həmçinin, əldə edilmiş nəticələrin düzgün kəmiyyət qiymətləndirilməsi üçün ilkin şərt istənilən genin məlum sayda nüsxəsini (məsələn, bir PCR reaksiyası üçün hepatit C geninin min nüsxəsini) ehtiva edən müsbət etibarlı nəzarət nümunələridir. Kəmiyyət nəzarətinin bir neçə ardıcıl seyreltmələri kalibrləmə əyrilərinin yaradılmasına imkan verir və klinik nümunələrdəki klinik genokopiyaların məzmununu qiymətləndirmək üçün istifadə olunur.
Kəmiyyət PCR-nin tərifində əsas nailiyyət yaradılması olmuşdursadə primerlərlə eyni vaxtda reaksiya qarışığına əlavə edilən və PCR prosesini vaxtında, yəni real vaxtda PCR-ni izləməyə imkan verən flüoresan DNT zondları.
TaqMan metodologiyası amplikonun orta hissəsinə xas olan və uclarında iki etiketi olan flüoresan DNT zondlarının sintezinə aiddir. Onlardan biri flüoresan etiket, ikincisi bu flüoresan üçün söndürücü molekuldur.
Flüorimetr və termoblok-gücləndiricinin hibridindən ibarət xüsusi cihaz hər bir sınaq borusunda flüoresansın daimi ölçülərini aparır (real vaxtda PCR prinsipi). 20-40 PCR dövründən sonra hər bir nümunə üçün fərdi əyrilər əldə ediləcək. Test nümunəsində olan istənilən genin nüsxələrinin sayı nəzarət nümunələri ilə kalibrləmə əyrilərindən hesablana bilər.
Həmçinin, PZR-nin flüoresan üsulla həyata keçirilməsinin mühüm xüsusiyyəti odur ki, nəticələr nəzərə alınarkən PZR qarışığı olan boruların açılmasına ehtiyac yoxdur. Bu, gücləndirici məhsullarla otağın çirklənməsi ehtimalını azaldır və elektroforez üçün xüsusi iş sahələrinin ayrılmasına ehtiyac yoxdur.
Kəmiyyətli PCR transkripti nəyi göstərir?
Nə kəşf edilir?
Kəmiyyət PCR kimi bir üsul vasitəsilə genlərdə keyfiyyət dəyişiklikləri aşkar edilir: daxiletmələr, silinmələr və nöqtə mutasiyaları. Lakin bəzi irsi pozğunluqlarda müvafiq əlamətlər müəyyən genlərin tərkibindəki dəyişikliyə cavab olaraq görünür.
TəşəkkürlərKəmiyyət təhlili, ən çox IU / ml ilə ədədi nəticə verir. Bu o deməkdir ki, sınaq nümunəsinin bir millilitrində beynəlxalq vahidlərlə ölçülən patogenin RNT və ya DNT-nin müəyyən sayda nüsxəsi tapılıb.
Bölgəsindən asılı olaraq infeksiyanın şiddəti diaqnozu qoyulur. Xəstəlik zamanı viruslar qanda sərbəst hərəkət etdiyi üçün adətən qan viral yükü müəyyən etmək üçün yoxlanılır.
Xüsusiyyətlər
Qan testində kəmiyyət PCR iki xüsusiyyətə malikdir.
- Təhlil formalaşmış PCR məhsulunun tərkibini dəqiq müəyyən etmək üçün flüoresan və ya radioaktiv etiketlə işarələnmiş primerlərin və ya deoksiribonukleozid trifosfatların iştirakı ilə aparılır.
- PZR prosesində çoxlu PCR məhsulları görünməzdən əvvəl reaksiyanı erkən bitirin. Bunun səbəbi, doymanın son mərhələsində, çoxlu PCR məhsulları olduqda, həm fermentin özü, həm də substratlar bu reaksiyanın məhdudlaşdırıcı əlaqələri kimi çıxış edir. Belə şəraitdə növbəti PCR dövrünün sonu artıq PCR məhsullarının sayının ikiqat artması ilə xarakterizə edilmir, müxtəlif nümunələr arasında əhəmiyyətsiz kəmiyyət fərqləri düzəldilir, bunlar bir sıra reaksiya dövründən keçdikdən sonra erkən mərhələlərdə olduqca aydın şəkildə müəyyən edilir..
PZR diaqnostikasının qiyməti
PZR tədqiqatının qiyməti var, hansı növ infeksiyanın yoxlanılacağından, analiz metodologiyasından və test materialından asılıdır. Bir infeksiyanı müəyyən etmək üçün içəridə verməlisiniz200-800 rubl. Biomaterialın götürülməsi üçün ödəniş də əlavə olunur - təxminən 400 rubl.
