Axın sitometriyası hüceyrələrin dərin təhlili üçün istifadə edilən sitoloji tədqiqat üsuludur. Onun üstünlüyü ondadır ki, o, hər bir hüceyrəni ayrı-ayrılıqda öyrənməyə imkan verir. Bu tip analiz bir neçə saniyə ərzində yüzlərlə hüceyrədə bir neçə parametri qiymətləndirməyə kömək edir. Nəticədə, sitofluorimetriya hazırda elm adamları və klinisyenler üçün mövcud olan ən sürətli və dəqiq analiz üsullarından biri hesab olunur.
Prinsip
Axın sitometriyasının prinsipi hüceyrələrin işığın səpilməsinin və lüminesansının (flüoresansının) ölçülməsinə əsaslanır. Hüceyrə süspansiyonu sitometr hüceyrəsindən yüksək sürətlə axın kimi keçir və burada lazerlə şüalanır. Sözdə hidrodinamik fokuslanma da orada həyata keçirilir. Onun mexanizmi ondan ibarətdir ki, çıxışda tədqiq edilmiş hissəcikləri olan hüceyrədən gələn axın daha yüksək sürətə malik olan xarici reaktivə axır. Nəticədə hissəciklər sıralı zəncirdə düzülür.
Ön hüceyrələr xüsusi flüoresan boyalarla (flüoroxromlar) etiketlənir. Onların sayəsində lazer şüasıikinci dərəcəli parıltı həyəcanlandırır. Qəbul edilən işıq siqnalları detektorlar tərəfindən qeydə alınır. Daha sonra məlumat bəzi meyarlara görə fərqlənən fərdi hüceyrə populyasiyalarını saymağa imkan verən proqram alqoritmlərindən istifadə etməklə işlənir.
Adi mikroskopiya ilə aparılan tədqiqatlar çox vaxt fərqli hüceyrələri ayırd edə bilmir, çünki onlar eyni görünür. Sitofluorimetriya digər məlumatları (DNT strukturunun bütövlüyü) təmin edə bilər, zülal ifadəsini, hüceyrə sağlığını təhlil edə bilər.
Ftoroxromların həyəcanlanması üçün müxtəlif dalğa uzunluqlu işıq şüaları, eləcə də müxtəlif növ detektorlar tələb olunduğu üçün müasir qurğular bir neçə aşkarlama kanalı ilə təchiz edilmişdir (4-dən 30-a qədər). Lazer emitentlərinin sayı 1-dən 7-ə qədər ola bilər. Daha mürəkkəb cihazlar eyni anda hissəciklərin bir neçə xassələrinin çoxparametrli tədqiqinə imkan verir.
Üstünlüklər və çatışmazlıqlar
Axın sitometriyasının üstünlüklərinə aşağıdakılar daxildir:
- yüksək emal sürəti (1 saniyədə 30 minə qədər hadisənin qeydiyyatı);
- çox sayda hüceyrəni öyrənmək imkanı (nümunədə 100 milyona qədər);
- Flüoresan işığın intensivliyinin ölçülməsi;
- hər xananın təhlili;
- heterojen proseslərin eyni vaxtda öyrənilməsi;
- hüceyrə populyasiyalarına görə verilənlərin avtomatik ayrılması;
- nəticələrin keyfiyyətli vizuallaşdırılması.
Bu texnologiyanın başqa bir xüsusiyyəti ondan ibarətdir kitəhlil edilən hissəcik bir neçə flüoresan məhlul ilə ləkələnə bilər. Bunun sayəsində çox parametrli araşdırma baş verir.
Dezavantajlara texniki avadanlığın mürəkkəbliyi və xüsusi nümunənin hazırlanması ehtiyacı daxildir.
Sitometrlər
Bu tipli ilk qurğular artıq 1968-ci ildə Almaniyada peyda olub, lakin çox sonralar geniş yayılıb. Hazırda axın sitometriyası üsulu ilə işləyən bütün cihazları 2 növə bölmək olar:
- flüoresan şüalanmanı (iki və ya daha çox dalğa uzunluğu), 10° və 90° işığın səpilməsini (aşağı bucaq və yan səpilmə detektoru) ölçən cihazlar;
- cihazlar ki, bir neçə mobil parametrləri ölçməklə yanaşı, bu meyarlara uyğun olaraq avtomatik olaraq qruplara bölünür.
İrəli səpilmə detektoru hüceyrənin ölçüsünü müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur və yan səpilmə cihazı hüceyrədaxili qranulların olması, sitoplazmanın və nüvənin həcm nisbəti haqqında məlumat əldə etməyə imkan verir.
Klassik sitometrlər işıq mikroskoplarından fərqli olaraq hüceyrə şəklini əldə etməyə imkan vermir. Bununla belə, son illərdə mikroskop və sitofluorimetrin imkanlarını birləşdirməyə qadir olan birləşdirilmiş qurğular hazırlanmışdır. Onlar aşağıda müzakirə olunacaq.
Təsvirləmə Sitometrləri
Klassik axın sitometriyasında istifadə olunan alətlər üçün,bir xüsusiyyət xarakterikdir: əgər analiz edilən hüceyrələrin populyasiyasında nadir hadisələr qeydə alınırsa, onların mahiyyətinin nədən ibarət olduğunu qiymətləndirməyin heç bir yolu yoxdur. Bu hissəciklər ya ölü hüceyrələrin qalıqları, ya da onların nadir bir qrupu ola bilər. Adi cihazlarda bu cür məlumatlar hadisələrin ümumi axınından xaric edilir, lakin məhz onlar elmi və klinik analiz üçün xüsusi dəyərə malik ola bilər.
Yeni nəsil görüntüləmə axını sitometrləri detektor zonasından axınla keçən hər bir hüceyrənin şəklini çəkməyə imkan verir. Kompüter monitorunda göstərilən diaqramın müvafiq sahəsinə klikləməklə bunu görmək asandır.
Tətbiq sahələri
Flow sitometriya tibb və elmin bir çox sahələrində istifadə olunan universal metoddur:
- immunologiya;
- onkologiya;
- transplantologiya (qırmızı sümük iliyinin, kök hüceyrələrin transplantasiyası);
- hematologiya;
- toksikologiya;
- biokimya (hüceyrə daxilində turşuluğun ölçülməsi, digər parametrlərin öyrənilməsi);
- farmakologiya (yeni dərmanların yaradılması);
- mikrobiologiya;
- parazitologiya və virusologiya;
- okeanologiya (su obyektlərinin vəziyyətini və digər vəzifələri qiymətləndirmək üçün fitoplanktonun tədqiqi);
- nanotexnologiya və mikrohissəcik analizi.
İmmunologiya
İnsan immun sistemi müxtəlif hüceyrələrdən ibarətdir. İmmunologiyada axın sitometriyası onların strukturunu və funksiyalarını qiymətləndirməyə, yəni morfofunksional həyata keçirməyə imkan verir.analiz.
Belə tədqiqat immunitetin mürəkkəb təbiətini anlamağa kömək edir. Hüceyrə fenotipləri antigenlərin aktivləşməsi, patologiyaların inkişafı və digər amillər nəticəsində dəyişir. Sitofluorometriya kompleks qarışıqda immun hüceyrələrin alt populyasiyalarını ayıra və zamanla onların bütün dəyişikliklərini qiymətləndirə bilər.
Onkologiya
Onkologiyanın ən mühüm vəzifələrindən biri hüceyrələrin tiplərinə görə fərqləndirilməsidir. Onkohematologiyada axın sitometriyası ilə analiz prinsipi aşağıdakı fenomenə əsaslanır: nümunə xüsusi flüoresan boya ilə müalicə edildikdə, sitoplazmik zülallarla birləşir. Aktiv şəkildə çoxalmış hüceyrələrdə bölündükdən sonra onun tərkibi yarıya qədər azalır. Müvafiq olaraq, hüceyrə lüminesansının intensivliyi iki dəfə azalır.
Proliferasiya edən hüceyrələri aşkar etməyin başqa yolları da var:
- DNT bağlayan boyaların istifadəsi (propidium yodid);
- etiketli urasil istifadəsi;
- hüceyrə dövrünün tənzimlənməsində iştirak edən siklin zülallarının artan ifadə səviyyəsinin qeydiyyatı.
