Xromatoqrafiya maddələrin ayrılması üsullarından biridir. Mikrohissəciklərin fiziki və kimyəvi xassələrinin sonrakı keyfiyyət və kəmiyyət təhlili üçün istifadə olunur. Bu texnologiyanın bir variantı yaxınlıq xromatoqrafiyasıdır. Molekulyar yaxınlıq xüsusiyyətindən istifadə edərək zülal birləşmələrinin diferensiallaşdırılması ideyası elmdə bir neçə onilliklər ərzində məlumdur. Bununla belə, o, öz inkişafını yalnız son illərdə, matris kimi istifadə edilən yüksək məsaməli hidrofilik materialların tətbiqindən sonra əldə etmişdir. Bu üsul həm analitik məsələləri (maddələrin ayrılması və onların identifikasiyası), həm də hazırlıq məsələlərini (təmizləmə, konsentrasiya) həll etməyə imkan verir.
Essensiya
Yaxşılıq xromatoqrafiyası (latınca affinis - “bitişik”, “əlaqəli” sözündəndir) yaxınlıq qarşılıqlı təsirlərinə əsaslanır, hansı ki, boşluq molekulu (liqand və ya affinant) ilə hədəf molekul arasında yüksək spesifik bağların əmələ gəlməsidir. Bu mexanizmlər təbiətdə geniş yayılmışdır (vasitəçilərin və ya hormonların və reseptorların əlaqəsi, antikorlar vəantigenlər, polinükleotidlərin hibridləşməsi və digər növ proseslər). Tibbdə yaxınlıq xromatoqrafiyası 1951-ci ildən praktiki məqsədlər üçün istifadə olunur
Komponentlər aşağıdakı kimi ayrılır:
- tərkibində təcrid olunacaq maddə olan işçi məhlul sorbentdən keçirilir;
- sorbent matrisinə yığılmış liqand bu maddəni saxlayır;
- konsentratdır (yığım);
- təcrid olunmuş maddənin həlledici ilə yuyulması yolu ilə sorbentdən çıxarılması.
Bu üsul bütün hüceyrələri təcrid etməyə imkan verir. Ənənəvi sorbsiya xromatoqrafiyasından fərq ondan ibarətdir ki, təcrid olunmuş komponentin sorbentlə güclü biospesifik bağlanması mövcuddur ki, bu da yüksək selektivliyi ilə xarakterizə olunur.
Adsorbentlər
Aşağıdakı maddələr adsorbent kimi istifadə olunur:
- Agardan alınmış polisaxarid olan agaroza əsaslanan gel birləşmələri. Ən çox istifadə edilənlər 3 növdür: sepharose 4B, CL (çarpaz bağlı agaroza) və affi-gel. Sonuncu kompozisiya agaroza və poliakrilamidin dəyişdirilmiş gelidir. Daha çox bioloji təsirsizliyə, yüksək kimyəvi və istilik müqavimətinə malikdir.
- Silisika (silikagel).
- Şüşə.
- Üzvi polimerlər.
Liqand təması zamanı mexaniki maneələri aradan qaldırmaq üçün onu daşıyıcıdan ayırmaq üçün əlavə maddələr (peptidlər, diaminlər, poliaminlər, oliqosakkaridlər) istifadə olunur.
Avadanlıq
Affinity xromatoqrafiya avadanlığına aşağıdakı əsas vahidlər daxildir:
- Mobil faza üçünsaxlama çənləri (eluent);
- orta tədarük üçün yüksək təzyiqli nasoslar (əksər hallarda pistonlu);
- elüentləri tozdan təmizləmək üçün filtr;
- dozalama cihazı;
- qarışıqların ayrılması üçün xromatoqrafik sütun;
- sütundan çıxan ayrılmış komponentləri aşkar etmək üçün detektor;
- xromatoqramma yazıcıları və mikroprosessor bloku (kompüter).
Həll edilmiş havanın miqdarını az altmaq üçün helium əvvəlcə mobil fazadan keçir. Eluentin konsentrasiyasını dəyişdirmək üçün proqramçı tərəfindən idarə olunan bir neçə nasos quraşdırılır. Xromatoqrafik sütunlar paslanmayan poladdan (korroziyaya davamlılıq üçün artan tələblər üçün), şüşədən (universal seçim) və ya akrildən hazırlanır. Hazırlayıcı məqsədlər üçün onların diametri 2 ilə 70 sm arasında dəyişə bilər. Analitik xromatoqrafiyada Ø10-150 µm mikro sütunlardan istifadə olunur.
Detektorların həssaslığını artırmaq üçün qarışığa reagentlər daxil edilir ki, bu da spektrin ultrabənövşəyi və ya görünən bölgəsində daha çox şüa udan maddələrin əmələ gəlməsinə kömək edir.
Metodika
Maye yaxınlıq xromatoqrafiyasının 2 əsas növü var:
- Sütunun stasionar faza ilə doldurulduğu və qarışığın içindən axınla keçdiyi sütuneluent. Ayırma təzyiq və ya ağırlıq altında baş verə bilər.
- Nazik qat. Eluent kapilyar qüvvələrin təsiri altında yastı adsorbent təbəqə boyunca hərəkət edir. Adsorbent şüşə boşqaba, keramika və ya kvars çubuğuna, metal folqaya tətbiq olunur.
İşin əsas mərhələlərinə aşağıdakılar daxildir:
- adsorbentin hazırlanması, liqandın daşıyıcı üzərində fiksasiyası;
- ayırma qarışığının xromatoqrafik sütuna verilməsi;
- mobil faza yüklənməsi, komponentlərin liqandla bağlanması;
- birləşdirilmiş maddəni təcrid etmək üçün faza dəyişdirmə.
Təyinat
Yaxşılıq xromatoqrafiyası aşağıdakı maddələr növlərini təcrid etmək üçün istifadə olunur (istifadə olunan liqandın növü mötərizədə göstərilir):
- enzimatik inhibitorların, substratların və kofaktorların (fermentlərin) analoqları;
- genetik yadlıq əlamətləri olan bioorqanik maddələr, viruslar və hüceyrələr (antikorlar);
- yüksək molekulyar ağırlıqlı karbohidratlar, monosaxarid polimerlər, qlikoproteinlər (lektinlər);
- nüvə zülalları, nukleotidiltransferazalar (nuklein turşuları);
- reseptorlar, nəqliyyat zülalları (vitaminlər, hormonlar);
- hüceyrə membranları (hüceyrələr) ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülallar.
Bu texnologiya immobilizasiya edilmiş fermentləri əldə etmək üçün də istifadə olunur və onların sellülozaya bağlanması immunosorbentlərin istehsalına imkan verir.
DNT bağlayan zülalların xromatoqrafiyası
DNT-ni bağlayan zülalların təcrid edilməsi istifadə etməklə həyata keçirilirheparin. Bu qlikozaminoqlikan geniş spektrli molekulları bağlamaq qabiliyyətinə malikdir. Bu qrupun zülallarının yaxınlıq xromatoqrafiyası aşağıdakı kimi maddələri təcrid etmək üçün istifadə olunur:
- tərcümənin başlaması və uzanması faktorları (nuklein turşusu molekullarının və zülalların sintezi);
- restriktazalar (iki zəncirli DNT-də müəyyən ardıcıllığı tanıyan fermentlər);
- DNT liqazaları və polimerazlar (yeni kimyəvi bağ yaratmaq üçün iki molekulun birləşməsini kataliz edən və DNT replikasiyasında iştirak edən fermentlər);
- immun və iltihabi proseslərdə mühüm rol oynayan serin proteaz inhibitorları;
- böyümə faktorları: fibroblast, Schwann, endotel;
- hüceyrədənkənar matrisin zülalları;
- hormon reseptorları;
- lipoproteinlər.
Ləyaqət
Bu üsul reaktiv birləşmələrin (fermentlər və daha böyük aqreqatlar - viruslar) izolyasiyası üçün ən spesifik üsullardan biridir. Bununla belə, o, təkcə bioloji aktiv maddələri təcrid etmək üçün istifadə edilmir.
Az miqdarda anticisimlərin aşkarlanması, poliadenil turşusunun kəmiyyətcə qiymətləndirilməsi, dehidrogenazların molekulyar kütlələrinin sürətli təyini, müəyyən çirkləndiricilərin çıxarılması, tripsinin qeyri-aktiv formasının aktivləşmə kinetikasının öyrənilməsi, insanın molekulyar quruluşu. interferonlar - bu, yaxınlığın istifadə edildiyi tədqiqatların bütün siyahısı deyil.xromatoqrafiya. Klinikada istifadəsi onun üstünlükləri ilə əlaqədardır, məsələn:
- Effektiv təmizləmə qabiliyyətizülallar, polisaxaridlər, nuklein turşuları. Onlar fiziki və kimyəvi xassələrinə görə bir qədər fərqlənirlər və hidroliz, denaturasiya və digər üsullarda istifadə edilən digər müalicə növləri zamanı aktivliyini itirirlər.
- Maddələrin ayrılma sürəti, prosesin dinamik xarakteri.
- Dissosiasiya sabitlərini təyin etmək üçün xüsusi fermentlərin təmizlənməsinə və izoenzimin homogenləşdirilməsinə ehtiyac yoxdur.
- Çox sayda maddələri ayıra bilir.
- Liqandların az istehlakı.
- Böyük həcmdə maddələrin ayrılması imkanı.
- Bioloji makromolekulların geri qaytarıla bilən bağlanma prosesi.
Bu texnika əlavə bir sahə (qravitasiya, elektromaqnit) tətbiq etmək üçün başqaları ilə birləşdirilə bilər. Bu, xromatoqrafiyanın texniki imkanlarını genişləndirməyə imkan verir.
Enzimatik mühəndislik
Bu üsul sayəsində biotexnologiyanın yeni sahəsinin - ferment mühəndisliyinin aktiv inkişafı başlandı.
Ferment izolyasiyası üçün yaxınlıq xromatoqrafiyası aşağıdakı üstünlüklərə malikdir:
- daha az vaxt nəticəsində böyük miqdarda fermentlərin alınması, nəticədə - onların qiymətinin azalması;
- fermentlərin immobilizasiyası onların tibb və sənayedə tətbiq dairəsini əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirə bilər;
- Fermentlərin həll olunmayan bərk dayaq ilə əlaqəsi təbii və fizioloji proseslərdə mühüm rol oynayan mikromühitin təsirini və reaksiyaların istiqamətini öyrənməyə imkan verir.
